小鼠主动脉内皮细胞是研究血管生物学、动脉粥样硬化、炎症反应及药物筛选的重要模型。其分离与培养技术对于心血管疾病的研究至关重要。本文详细介绍小鼠主动脉内皮细胞的分离、纯化和培养方法，以确保获得高纯度和高活性的细胞。
实验材料与仪器
试剂
-磷酸盐缓冲液（PBS，无钙镁）
-胶原酶（TypeII，0.1%-0.2%）
-内皮细胞培养基（如DMEM/F12+20%FBS+1%ECGS+1%青霉素/链霉素）
-70%乙醇（用于消毒）
-红细胞裂解液（可选）
仪器与耗材
-超净工作台
-CO?培养箱（37°C，5%CO?）
-手术器械（眼科剪、镊子、显微镊）
-细胞筛（100μm和40μm）
-离心机
-0.1%明胶包被的培养皿
实验步骤
1.小鼠主动脉的获取
1.小鼠：采用CO?窒息或颈椎脱臼法处死小鼠，并用70%乙醇消毒体表。
2.解剖主动脉：
-沿腹中线剪开胸腔和腹腔，暴露心脏和主动脉。
-用镊子轻轻提起心脏，剪断主动脉弓，并沿胸主动脉向下分离至髂动脉分叉处。
-将主动脉完整取出，置于预冷的PBS中，去除周围脂肪和结缔组织。
2.主动脉消化与内皮细胞分离
1.酶消化法：
-将主动脉纵向剪开，用PBS冲洗3次以去除血液。
-浸泡于0.1%-0.2%胶原酶溶液中（37°C，15-30分钟），期间轻柔振荡促进消化。
-消化完成后，加入含血清的培养基终止反应。
2.细胞收集：
-用移液枪反复吹打主动脉碎片，释放内皮细胞。
-过100μm和40μm细胞筛去除未消化组织，收集细胞悬液。
-离心（1000rpm，5分钟），弃上清，用内皮细胞培养基重悬细胞。
3.内皮细胞的纯化
-差速贴壁法：将细胞悬液接种于未包被的培养皿中（37°C，1小时），使成纤维细胞优先贴壁，随后收集未贴壁的内皮细胞。
-磁珠分选（可选）：使用CD31或CD144抗体标记内皮细胞，通过磁珠分选提高纯度。
4.内皮细胞的培养
1.培养皿包被：使用0.1%明胶（37°C，1小时）或纤连蛋白包被培养皿，提高内皮细胞贴壁率。
2.细胞接种：将纯化的细胞接种于包被的培养皿中，加入内皮细胞培养基（含20%FBS和ECGS）。
3.培养条件：
-37°C，5%CO?，饱和湿度培养。
-每2-3天换液一次，观察细胞形态（呈鹅卵石样铺路石状）。
4.传代：当细胞融合度达80%-90%时，用0.25%胰酶消化传代（1:2或1:3比例）。
注意事项
1.无菌操作：所有步骤需在超净台内进行，避免污染。
2.消化时间控制：胶原酶消化时间过长可能导致细胞损伤，需优化实验条件。
3.细胞鉴定：可通过免疫荧光检测CD31、vWF或eNOS等内皮标志物确认细胞纯度。
4.避免过度传代：原代内皮细胞传代次数建议不超过5代，以防表型丢失。
更新时间：2025-08-14
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